PCR(聚合酶链反应)扩增程序的设置通常包括以下关键步骤:
启动PCR仪
打开PCR仪的电源开关。
准备PCR离心管
将PCR离心管的顶盖向上扳,再往前推,露出放样孔。
在放入PCR管前,确保反应体系各组分已加好。
放入PCR离心管后,盖好顶盖。
新建PCR程序
按F2键“Create”新建一个扩增的PCR程序。
使用控制台面的上下左右方向键移动编辑位置,输入所需的温度、时间、循环数等参数。
输入反应体积
根据PCR离心管中加入的反应体积总量,在“Reaction volume”后输入相应数值。
选择合适的体积档位,如Std“1~100ul”或9600“1~50ul”。
启动扩增
按F1键“Start”启动PCR扩增。
监控扩增过程
按“INFO”键查看PCR扩增信息。
扩增完成后,按台面左方的“Stop”键退出。
查看历史记录
按“Hist”键查看上次扩增的历史记录。
具体参数设置
变性温度:通常在94-98℃之间,时间1-3分钟,以解离DNA双链。
退火温度:根据引物的设计和模板的GC含量,通常在50-60℃之间,时间30秒至1分钟。
延伸温度:通常在72℃左右,时间1分钟,具体根据引物长度和DNA聚合酶活性调整。
循环数:通常在20-40次之间,具体根据扩增需求和模板复杂性调整。
特殊PCR程序
降落PCR(Touchdown PCR):退火温度从比引物Tm值高5-10℃开始,每个循环逐步降低退火温度,以提高特异性。
两步法PCR:适用于GC-rich片段,退火延伸温度设置为68℃,时间为退火和延伸的总时间。
注意事项
确保PCR仪的使用环境条件和对电源的要求符合要求。
打开PCR仪机盖时要轻,防止损坏机锁。
PCR基因扩增仪工作时严禁打开机盖。
通过以上步骤和参数设置,可以有效地进行PCR扩增,获得所需的DNA片段。