梯度洗脱程序是一种在高效液相色谱（HPLC）中常用的技术，用于改善复杂样品的分离效果。其基本原理是在分离过程中连续改变流动相的组成，通常包括以下几种方法：
低压梯度（外梯度）
预先按一定程序将两种或多种不同极性的溶剂混合。
使用一台高压泵将混合后的溶剂输入色谱柱。
高压梯度（内梯度系统）
利用两台高压输液泵，分别将两种不同极性的溶剂按设定比例送入梯度混合室。
混合后，溶剂进入色谱柱。
梯度洗脱程序的分类
线性梯度：流动相的极性在整个分析周期内以恒定比例变化。
非线性梯度：流动相的极性在整个分析周期内按照某种预定的函数变化，如指数、二次函数等。
梯度洗脱的特点
提高柱效：通过改变流动相的极性，使每个组分都有合适的容量因子，从而提高分离效果。
改善检测器的灵敏度：梯度洗脱有助于提高检测器的信号强度，使组分更易于检测。
梯度洗脱的应用
梯度洗脱特别适用于成分复杂的样品，如生物样品、药物分析等，能够有效分离性质差异较大的组分。
梯度洗脱的关键注意事项
选择合适的溶剂比例和变化程序，以确保各组分能够有效分离。
考虑流动相的稳定性，避免在洗脱过程中出现气泡或浓度突变。
监控梯度洗脱过程中的流量和压力，确保色谱柱的正常运行。
通过以上步骤和注意事项，梯度洗脱程序能够显著提高HPLC的分离能力和分析效率，成为现代色谱分析中不可或缺的一部分。